pan-Aves


Zleva doprava: ara hyacintový (Anodorhynchus hyacinthinus), zdroj: flickr.com (JMJ32); Gigantoraptor a Alectrosaurus, autor Luis V. Rey

Proč neexistují "běžci" (Ratitae), díl 2. – neusaditelné tinamy a 40 nových genů

Viz také:

    V předchozím díle minisérie jsem ukázal, jak se zrodila hypotéza o "běžcích" coby polyfyletickém seskupení ptáků v rámci monofyletické skupiny Palaeognathae, a vyjmenoval jsem nedlouhou řádku studií, které tento závěr zatím podpořily. Zatím jsem ale neukázal důvod, proč by tento scénář měl být důvěryhodnější než všechny alternativy, zvláště když morfologické i molekulární studie pro "běžčí" monofylii v předchozích dekádách snesly tolik důkazů. To by měl článek níže napravit.

Byl jsem v zoo! Vlevo nandu Darwinův (Rhea/Pterocnemia pennata), vpravo emu hnědý (Dromaius novaehollandiae). Souboj se bude vést o fylogenetickou blízkost k tinamám; jako zbraně si oba soupeři volí 40 jaderných genů, mtDNA, biogeografii a zapadlé morfologické studie (Zdroj: autorova fotografie)

1. Smith et al. 2012: fylogenetika, metody a problémy

    Skupina autorů z týmu Early Bird se rozhodla ověřit otázku asi ze všech nejdůležitějších, totiž jak dobře si vlastně hypotéza "běžčí" polyfylie stojí. Důvodů k pochybám je několik. Zaprvé existuje několik studií jaderných genů, které monofylii skupiny "Ratitae" podpořily (např. již citovaní García-Moreno & Mindell 2000). Zadruhé jednotlivé "běžce" stále spojuje velké množství odvozených morfologických znaků, především pak z postkrania, a ačkoli je lákavé odvysvětlit je neotenií, nikdy nebylo prokázáno, že neotenie dokáže v případě "běžců" vyprodukovat dostatečně mnoho konvergencí k tomu, aby zkreslovala výsledky fylogenetických analýz. Zatřetí ani datasety tak velké, jako jsou ty sestavené týmem Early Bird (Hackett et al. 2008; Harshman et al. 2008), nejsou zárukou dosažení správných výsledků. Např. postavení žebernatek v rámci metazoí je případem, kdy i velmi velké datasety podávají rozporuplné výsledky. Zvětšování datasetu je dobrou strategií pro eliminaci náhodného šumu, ale v molekulární evoluci je zdokumentováno mnoho jevů, které mohou výsledky analýzy zkreslit nenáhodně, tj. určitým směrem. Dvěma takovými biasy jsou přitahování dlouhých větví (long branch attraction) a konvergence na podobném zastoupení bází v sekvenci (base composition bias) a právě pomocí nich zastánci "běžčí" polyfylie vysvětlují, proč monofyletičtí "běžci" vycházeli i z tolika molekulárních studií: tinamy jsou dlouhá větev a přitahují se k outgroup, pštrosi zase sdílejí nozký obsah tyminu s cytozinem v mitochondriálním genomu s kivii a kasuárovitými.
    Krom těchto jevů ale může fylogenezi zkreslit i nesoulad mezi genovými stromy (gene trees) a druhovými stromy (species trees) v důsledku nekompletního třídění linií. Smith et al. (2012) je sice necitují, ale Baker & Haddrath (2010) v abstraktu z předloňského ornitologického kongresu navrhli, že by "běžčí" polyfylie mohla být artefaktem právě tohoto jevu. Na tomtéž místě zmiňují, že když na rozsáhlý, dosud nepublikovaný dataset aplikovali pokročilé bayesovské metody pro rekonstrukci druhového stromu místo prostého zřetězení (concatenation) sekvencí jednotlivých genů, vyšli jim "běžci" zase monofyletičtí. A s tím, jak poznáváme lépe a lépe zákonitosti genomové evoluce, nacházíme nové a nové problémy. Co třeba heterotachie, tedy jev, při němž se rychlost substituce na jediné nukleotidové pozici mění v čase (a tedy napříč fylogenetickým stromem)? Nechceme-li se vzdát výhod parametrických metod, musíme využít modelů, které věrohodnost pro každý znak počítají jako vážený součet přes několik množin délek větví (mixture models). Jenže Matsen & Steel (2007) ukázali, že analýza dvou genů, jejichž fylogenetické stromy se liší pouze v délkách větví (tj. topologie genových stromů je stejná), nám pod "mixture model" může vyhodit strom s topologií úplně odlišnou. Problémy jsou i s alignmentem: fylogenetická analýza špatně zarovnaných sekvencí vyhodí špatný strom. A nemělo by se zapomínat ani na to, že podpora jednotlivých uzlů je skoro důležitější než samotný bodový odhad stromu, takže teoretičtí fylogenetici se vyžívají v hledání situací, kdy naprosto chybné klady obdrží vysoké hodnoty bootstrapu a posteriorních pravděpodobností. Co když je drasticky nadhodnocena např. vysoká podpora pro nepštrosí paleognáty v analýzách Harshmana a spol.?
    Smith a spol. proto otestovali hypotézu "běžčí" polyfylie jednou z nejjednodušších metod vůbec: vzali nezávislá data (tj. ta, která nebyla zahrnuta v žádné z analýz, která původní hypotézu podpořila) a podívali se, co z nich vyleze. Podobné testování kontroverzních hypotéz má v ptačí systematice tradici: Morgan-Richards et al. (2008) se takto podívali na zoubek kladu Metaves skrze mitochondriální data (a hypotézu zamítli), Wang et al. (2011) loni zase s 30 novými jadernými geny ověřovali existenci skupiny Eufalconimorphae, složené z pěvců, papoušků a sokolů (hypotézu v plném rozsahu potvrdili, ale ukázali, jak zoufalá je situace v případě myšáků). Smith a spol. jsou ještě o něco ambicióznější: předkládají hned 40 zbrusu nových lokusů roztroušených po celém jaderném genomu. Dohromady dávají přes 22 000 bází, což konkuruje původnímu datasetu Harshmana a spol., a lze mezi nimi najít i "anonymní lokusy", tzn. náhodné fragmenty genomu, které mohou zahrnovat i dlouhé introny a mezigenové regiony. Pokud by tyto oblasti genomu nesly jiný signál než exony, krátké introny a UTRs použité Harshmanem a spol., Smith et al. (2012) by to dokázali zjistit.
    Zarovnávání sekvencí Smith a spol. provedli manuálně ("eyeball alignment"), přičemž problematické sekvence bez milosti vyřazovali. Zároveň ale vyzkoušeli i trochu jiný postup: aby prověřili, jak moc je analýza na zarovnání citlivá, nakrmili program PRANK (provádějící alignment automaticky na základě maximální věrohodnosti) 15 tzv. "guide trees". Jelikož se PRANK snaží určit, za kterou mezeru (gap) v zarovnané sekvenci je zodpovědná delece a za jakou inzerce, potřebuje strom – "guide tree" –, na němž by mohl zrekonstruovat ancestrální sekvence. Když se mu žádný nezadá, PRANK si ho sestaví sám skrze neighbor-joining, ale Smith et al. (2012) této možnosti nevyužili. Místo toho mu postupně zadali všechny stromy, které uznali za realistické: "realističnost" přitom předpokládá monofylii nanduů (Rhea + Pterocnemia), monofylii tinam (Tinamus + Crypturellus) a pevně fixovanou topologii outgroup (která předpokládá monofylii hrabavých a drůbeže, čili opět nic kontroverzního). Proměnlivé byly jen vztahy pštrosů, nanduů, tinam a emu, což dá výše zmíněných 15 stromů. Délky jejich větví autoři spočítali pomocí věrohodnostní analýzy nad manuálním alignmentem.
    Pokud jde o hlavní analýzu, byli Smith a spol. velice opatrní. Konstatují, že obrovské mnohalokusové datasety sice slibují mnohé, ale jen tehdy, pokud nespadají do problematické oblasti parametrového prostoru: narážejí na "anomální zónu", kterou popsali Degnan & Rosenberg (2006) a která má potenciál být fylogenetiky vyslovována se stejným nádechem zlověstnosti, jenž už léta doprovází zónu Felsensteinovu. V této zóně mají druhové stromy takovou kombinaci krátkých vnitřních větví, která vygeneruje genové stromy odporující stromu druhovému častěji než ty, které se s druhovým stromem shodují. Kubatko & Degnan (2007) pak ukázali, že k tomu, aby se maximální věrohodnost stala při rekonstrukci druhového stromu ze zřetězených sekvencí statisticky nekonzistentní, se stačí k obávané zóně jen přiblížit. Smith s kolektivem tedy proto kromě zřetězeného datasetu analyzovali metodami nejvyšší parsimonie a věrohodnosti i každý lokus zvlášť, přičemž věrohodnostní analýzu ještě provedli jak s jedním modelem naraženým na celý dataset, tak i se samostatným modelem pro každý lokus. Trojku hlavních fylogenetických metod doplnila bayesovská inference, pod níž lze navíc nasadit modely adresující výše zmíněný problém heterotachie. Smith et al. (2012) vyzkoušeli hned dva: jednak "mixture model" popsaný výše, jednak "covarion model", který se heterotachii pokouší obelstít trochu jinak: používá skrytý Markovův proces*, který dovoluje, aby se nukleotidové pozice během své evoluce přepínaly ze stavu "off" (kdy na nich žádné substituce neprobíhají) do stavu "on", kdy k mutacím dochází normálně (Kolaczkowski & Thornton 2008). Tato celkem jednoduchá původní myšlenka Tuffleyho a Steela (1998) byla časem doplněna řadou rafinovaných vymyšleností, takže původní binární volba "on/off" byla rozšířena na výběr z vícero rychlosntních kategorií (takový model vlastně dělá s variací v tempu substituce napříč časem totéž, co klasický gama parametr s variací v tempu substituce napříč nukleotidovými pozicemi) a posléze i kombinaci obou předchozích možností.

*To, že je Markovův, znamená, že pravděpodobnost další události nezávisí na událostech předchozích. V jazyce molekulární evoluce to znamená, že důležité je jen to, jaký je stav nukleotidové pozice teď, ne to, jaký byl předtím. To, že je skrytý, znamená, že jeho jednotlivé stavy nemůžeme přímo pozorovat – tyto "skryté" stavy jsou ale nějakým mechanizmem propojeny s pozorovatelnými výstupy a lze je z nich odhadnout.

    Rozpory mezi genovými a druhovými stromy Smith a spol. zjišťovali pomocí programu BUCKy, který bayesovsky (dvojnásobnou aplikací Markovových řetězců Monte Carlo) odhaduje tzv. faktory konkordance (shody), tedy procento genomu, které podporuje zadaný klad. Jako každá bayesovská metoda, i BUCKy vyžaduje specifikování priorní pravděpodobnosti: zde jde o parametr α, který vyjadřuje apriorní přesvědčení systematika o tom, jak moc si budou jednotlivé genové stromy z jeho datasetu navzájem odporovat (α = 0: vůbec, α = ∞: historie jednotlivých genů budou absolutně nezávislé). S priorními pravděpodobnostmi je vždycky trochu potíž: ve fylogenetice třeba panuje shoda na tom, že všechny topologie by měly mít stejný prior – žádný strom bychom neměli upřednostňovat dřív, než analyzujeme data. Podstatně kontroverznější je volba priorů pro délky větví, a bayesovsky založení biologové si stěžují, že největší výzkum v oblasti priorních pravděpodobností se soustředí na to, jak je učinit neinformativními (Ronquist & Deans 2010). Ze Smithe a jeho spoluautorů by ale Ronquist s Deansem měli radost: jejich alfa je informativní, odvozená z předchozích studií paleognátí fylogeneze (Harshman et al. 2008; Phillips et al. 2010) a poskytující následující roztomilé priorní rozdělení pro počet odlišných genových stromů:

Program BUCKy má skvělý web, který z počtu genů, počtu taxonů a hodnoty parametru α spočítá priorní rozdělení pro počet genových stromů s odlišnými topologiemi. Smith et al. (2012) na základě předchozích studií nastavili alfu na 3, což spolu s použitými 40 lokusy a 6 ingroup taxony (emu, pštros, 2 tinamy, 2 nanduové) vyhodí toto rozdělení, podle nějž máme očekávat něco čtyřmi a dvanácti rozpornými stromy. Vytvořeno pomocí webové podpory pro BUCKy

Totéž, tentokrát pro 4 taxony (vnitřní diverzita nanduů a tinam zanedbána). Počet očekávaných genových stromů najednou klesá na 3 – práve tolik topologií nakonec skutečně mělo nenulovou posteriorní pravděpodobnost.

    Autoři použili BUCKy ke dvěma účelům: jednak aby určili, kolik lokusů podporuje ten který klad, jednak k rekonstrukci druhového stromu pomocí "kvartetové metody", která má tu příjemnou vlastnost, že je statisticky konzistentní a lze garantovat, že správnou topologii druhového stromu najde i tehdy, když neodpovídá nejčastěji pozorovanému genovému stromu. Vyhýbá se tak výše zmíněné anomální zóně a bere v úvahu fakt, že postup, který Dawkins (2004) popsal jako "demokratické hlasování" jednotlivých genů, může být při rekonstrukci evoluční historie organizmů a populací zavádějící. Nevýhodou je pak skutečnost, že statistické konzistence může dosáhnout jen tehdy, když jsou faktory konkordance odhadnuty správně. Autoři ale dokázali obejít i tento požadavek. Rozdělili genové stromy do dvou kategorií – na ty, na nichž klad všech nepštrosích paleognátů je, a na ty, na kterých není – a pak spočítali, kolik stromů by v obou kategorií mělo být, pokud by klad nepštrosích paleognátů neexistoval (na druhovém stromě). Následně použili statistický test, aby zjistili, zda lze tuto nulovou hypotézu zamítnout.
    Jako tečku za záplavou dílčích analýz Smith et al. (2012) zkombinovali svá data se sekvencemi Harshmana a spol. (2008) a Phillipse a spol. (2010), čímž složili supermatici atakující 60 kilobází. Podobný postup zvolili Wang et al. (2011) při loňském přetestování sesterského vztahu mezi pěvci a papoušky: ať už spolu jednotlivé datasety budou souhlasit nebo ne, nejrobustnějších výsledků dosáhneme, když je spojíme dohromady. Analýzy provedené nad tímto datasetem byly celkem dvě: jedna s minimálním taxon samplingem, tj. pouze s taxony společnými pro všechny dílčí datasety (pštrosa, dvě tinamy, oba nanduy a emu), druhá měla naopak taxon sampling maximální, zahrnující všechny taxony přítomné aspoň v jednom datasetu – celkem tedy pštrosa, oba nanduy, čtyři tinamy, tři ptáky moa, tři kivie, emu a kasuára. Dva kiviové a všichni moa byli v analýze reprezentováni výhradně mitochondriálními sekvencemi. Na oba tyto datasety byla nasazena parsimonie, věrohodnost i bayesovská inference; data byla opět roztříděna do několika oddílů se zvláštním modelem pro každý jeden jaderný gen. V detailech analýzy mitochondriální části datasetu Smith s kolektivem následovali to, co zvolili Phillips et al. (2010). 

2. "Běžci" verzus nepštrosí paleognáti: souboj hypotéz na život a na smrt

    Ve stručnosti: klad nepštrosích paleognátů (a tím pádem polyfylie "běžců") byl jednoznačně potvrzen. Nejprve autoři prozkoumali obsah 95% kredibilní množiny stromů (95% credible set of trees). Tuto množinu dostaneme tak, že ve vzorku, který sestavily Markovovy řetězce Monte Carlo (MCMC) v průběhu bayesovské analýzy, seřadíme jednotlivé stromy podle jejich posteriorní pravděpodobnosti (PP). Postupujeme od stromu s nejvyšší posteriorní pravděpodobností k méně a méně pravděpodobným stromům, dokud celková posteriorní pravděpodobnost nedosáhne hodnoty 0,95. Asi se do ní netrefíme úplně přesně (když má 1. strom PP 0,45, druhý 0,35 a třetí 0,18, celkový součet je už 0,98), ale jak ve své výborné studii o interpreaci bayesovských pojmů a měřítek ukázali Huelsenbeck & Rannala (2004), to lze napravit tím, když strom překračující 95% hranici zahrneme jen s pravděpodobností odpovídající tomu, o kolik ji překračuje. Ukázalo se, že v 95% kredibilní množině stromů se nachází jen jediná topologie, a ta obsahuje nepštrosí paleognáty. Topologie, na nichž se vyskytují monofyletičtí "běžci", byly vyloučeny dokonce z 99% kredibilní množiny stromů: ač tvoří 3 z 15 (tj. 20%) možných zakořeněných stromů popsaných výše, na posteriorní pravděpodobnosti se podílejí méně než 1%.
    "Běžčí" polyfylii ve výsledcích určitě nelze svést na heterotachii, tedy změny v rychlosti evoluce za čas. Bayesovská analýza s využitím "covarion" a "mixture" modelů evoluce odhalila monofyletické nepštrosí paleognáty zase, a to s posteriorní pravděpodobností 1. Ukázalo se navíc, že MCMC pro většinu větví nezvolily víc než jednu délku (ačkoli klidně mohly). Rozbor jednotlivých genových stromů ukázal, že 24 z 38 lokusů podporuje monofylii nepštrosích paleognátů ve věrohodnostní i bayesovské analýze, zatímco pod úspornostní analýzou je to 15 z 38 (chybějící 2 lokusy nemohly být osekvenovány od jednoho z paleognátích taxonů, a tak je autoři pro teď ignorovali) – v obou případech je to víc než 16% a méně procent, které bychom očekávali, kdyby takový klad nebyl přítomen na druhovém stromě. Podle autorů může menší podpora ze strany parsimonie odrážet náchylnost metody k přitahování dlouhých větví, zde tedy konkrétně dlouhé větve tinam k dlouhé větvi outgroup. Faktor konkordance ukazuje, že monofylii nepštrosích paleognátů podporuje 93% genomu – 95% interval kredibility (tj. interval, který s pravděpodobností 95% obsahuje správnou hodnotu) je 84% až 99%. A zatímco Degnan & Rosenberg (2006) ukázali, že v anomální zóně budou upřednostňovány symetrické genové stromy, i když je "pravý" (druhový) strom asymetrický, autoři zaznamenali jediný symetrický genový strom. Dokonce i po vyloučení asymetrických stromů s nepštrosími paleognáty se ve zbylém vzorku stále nejčastěji vyskytuje asymetrický strom, na němž jsou sesterskou skupinou všech ostatních paleognátů nanduové (což opět implikuje "běžčí" polyfylii). Zdá se tedy, že v rozporu se závěry Bakera a Haddratha (2010) nonmonofylie "běžců" není artefaktem nekompletního třídění linií a následných konfliktů mezi genovými stromy a druhovým stromem. Přídavné rozbory dále ukázaly, že monofyletičtí nepštrosí paleognáti jsou stejnou měrou podporováni anonymními markery a intronovými sekvencemi a že mezi lokusy podporujícími a odporujícími "běžčí" polyfylii nejsou žádné podstatné rozdíly v zastoupení jednotlivých bází. Klad nepštrosích paleognátů je tedy podpořen silným signálem rozloženým po celé šíři genomu.

Fylogenetický strom vzešlý z analýzy 40 lokusů v programu BUCKy, navrženém ke statisticky konzistentnímu odhadování druhových stromů ze vzájemně rozporných stromů genových. Čísla nad větvemi udávají, jaká část genomu podporuje existenci dané větve, čísla dole pak pro tento údaj poskytují 95% interval kredibility. Je vidět, že zatímco monofylii nepštrosích paleognátů podporuje stejné procento genomu jako monofylii hrabavých (větev Gallus + Crax) nebo kladu Galloanserae, tedy skupin zcela nekontroverzních, podpora pro větev sjednocující emu a tinamy je velmi slabá. Šedý obdélník vyznačuje taxony historicky řazené mezi "běžce" (Zdroj: Smith et al. 2012: Figure 3)

3. Kam s tinamami

    Mohlo by se zdát, že fylogenomika už všechny otázky paleognátí fylogeneze vyřešila: "běžce" musíme zavrhnout, nejbazálnějšími žijícími paleognáty jsou ve skutečnosti pštrosi a kiviové nestojí nějak zvlášť blízko báze paleognátů, ale hned vedle odvozených kasuárovitých (Hackett et al. 2008; Harshman et al. 2008; Smith et al. 2012). Víme dokonce víc, než bychom se odvažovali doufat: nejintenzivnější výzkum v oblasti studia pravěké DNA (tzv. "ancient DNA", aDNA) se nyní zaměřuje na ptáky moa (Allentoft & Rawlence 2011), kde se podařilo získat sekvence od stovek různých exemplářů a od kompletních mitochondriálních genomů se skrze mikrosatelity pomalu, ale jistě přesouváme k jadernému materiálu. MtDNA nejenže rozřešila vzájemné vztahy mezi jejich jednotlivými taxony (Bunce et al. 2009), ale pomohla tyto taxony i vymezit – v čemž selhala morfologie, neschopná odlišit geografickou variaci a pohlavní dimorfizmus od informativních rozdílů (viz revizi v Allentoft & Rawlence 2011) – a ukázala, že moa jsou sesterskou skupinou tinam (Phillips et al. 2010). Tento vztah zatím podpořila jediná studie, ale setkal se buď přímo s rychlým přijetím (Allentoft & Rawlence 2011), nebo neutrální reakcí ve stylu "bude potřeba víc dat" (Mayr 2011). Worthy & Scofield (2012) jej sice v dosud největší provedené morfologické analýze paleognátů neodkryli a vrátili se k hypotéze o monofyletických "běžcích", aspoň ale nepotvrdili ani nejzávažnější konkurenční hypotézu, totiž sesterský vztah moa a kiviů, a jejich pokus podat výsledky molekulárních studií jako nejednozančné vyzněl poněkud zoufale.
    Technicky vzato tak není vůbec těžké otázku z nadpisu zodpovědět: tinamy pravděpodobně patří hned vedle ptáků moa. Ovšem na problému, kam s výsledným příbuzenským svazkem dál, si vylámaly zuby desítky jaderných lokusů i morfologických znaků a jde jednoznačně o nejzávažnější (a do jisté míry i poslední skutečný zbývající) problém ve fylogenetice žijících paleognátních ptáků. V rámci nepštrosích paleognátů, jejichž monofylii už můžeme bezpečně předpokládat (viz výše), rozeznáváme mimo tinam dvě další monofyletické skupiny. Jsou to nanduové (Rheidae nebo Rhea) a australasijští běžci, mezi jejichž žijící zástupce patří kiviové (Apteryx), emu (Dromaius) a kasuáři (Casuarius); pravděpodobně sem však patří i sloní ptáci (McDowell 1948*; Cooper et al. 2001; Phillips et al. 2010). Pro tři taxony lze sestrojit tři zakořeněné stromy, a právě tolika způsoby můžeme umístit tinamy na paleognátí strom – a pro každý z nich existuje nějaká podpora. Tinamy by mohly být sesterskou skupinou k australasijským běžcům a nanduové stát mimo (Chojnowski et al. 2008; Hackett et al. 2008; Harshman et al. 2008: věrohodnostní analýza s normálním kódováním, bayesovská analýza; Phillips et al. 2010), nebo by australasijští běžci mohli tvořit sesterský taxon ke kladu složenému z tinam a nanduů (Harshman et al. 2008: věrohodnost s RY kódováním, úspornostní analýza), a nebo by se tinamy mohly nacházet zcela mimo skupinu tvořenou nanduy a australasijskými běžci (Johnston 2011). Horší je, že 40 nových lokusů s celým problémem prakticky vůbec nepomáhá.

*Je to překvapivé, ale McDowellova studie, která si získala takovou oblibu mezi zastánci paleognátí polyfylie, předkládá silné důkazy pro sjednocení sloních ptáků s kivii, tedy přesně tentýž vztah, který vyhodilo i několik stovek bází mtDNA pracně vydolovaných ze subfosilního tibiotarzu o více než půl století později. Oba taxony sdílí tvar i pozici bazipterygoidních výběžků, kost patrovou ve tvaru silně zakřiveného tenoučkého plátu a rozdvojený přední konec křídlové kosti. McDowell si nebyl svazkem obou taxonů na základě svých pozorování příliš jist, ale jejich shoda s novou molekulární evidencí je pozoruhodná.

Nad rozšířeným taxon samplingem (tj. včetně kiviů, kasuára, ptáků moa atd.):
  • věrohodnostní (ML) analýza s jedním modelem evoluce pro celý zřetězený dataset spojuje klad moa/tinamy s nanduy;
  •  věrohodnostní (ML) analýza se samostatným modelem evoluce pro každý jeden lokus spojuje klad moa/tinamy s nanduy; 
  • bayesovská analýza spojuje klad moa/tinamy s australasijskými běžci;
Nad omezeným taxon samplingem, zahrnujícím jen taxony z původní 40-lokusové analýzy:
  • úspornostní (MP) analýza spojuje tinamy s nanduy;
  • věrohodnostní (ML) analýza s jedním modelem evoluce pro celý zřetězený dataset spojuje tinamy s nanduy;
  • věrohodnostní (ML) analýza se samostatným modelem evoluce pro každý jeden lokus spojuje tinamy s australasijskými běžci;
  • bayesovská analýza se samostatným modelem evoluce pro každý jeden lokus spojuje tinamy s australasijskými běžci;
  • druhový strom rekonstruovaný z genových stromů pomocí BUCKy spojuje tinamy s australasijskými běžci
    Měřítka podpory nepomohou; jsou slabá a bootstrap často sklouzává pod 50%. Výjimkou je posteriorní pravděpodobnost kladu (tinamy + emu) v analýze s omezeným taxon samplingem, která činila 0,94. Je ale všeobecně známo, že bayesovské posteriorní pravděpodobnosti (PP) mají sklon podporu přehánět – o to překvapivější pak je, že při analýze nejširšího taxon samplingu poklesla na ubohých 0,54 i PP kladu (tinamy + moa + australasijští běžci). V úspornostní analýze zase překvapivě narostl bootstrap (87%). Celkově je ale situace zoufalá: různé metody vyhazují různé vztahy a začíná se projevovat i citlivost na alignment. Alignmenty vygenerované PRANKem podle všech 15 pomocných stromů popsaných výše pod věrohodnostní analýzou vyhodily klad nepštrosích paleognátů se 100% bootstrapovou podporou, ale na fylogenetické pozici tinam už se neshodly. Z 15 "guide trees" 3 obsahovaly klad (tinamy + nanduové) nezahrnující žádné jiné paleognáty, a analýzy alignmentů sestavených podle těchto orientačních stromů vždy tento klad odkryly taky. Analýzy zbývajících 12 alignmentů až ale tento klad neodkryly ani jednou: dvakrát se zde vyskytla topologie ((emu, nanduové), tinamy), shodná s tím, co odkryl na základě morfologie Johnston (2011), a desetkrát topologie (nanduové, (tinamy, emu)). Klad složený z emu a tinam a vylučující nanduy se přitom objevil i v analýzách takových alignmentů, které byly sestaveny na základě orientačních stromů neobsahujících tento klad.
    Naději, která zdánlivě svítá z odlišné citlivosti obou hypotéz na alignment, rychle zabíjí analýza v BUCKy. Ta sice opět vykrývá klad emu/tinamy vylučující nanduy, ale zároveň ukazuje, že ho podporuje jen 51% celého datasetu, přičemž 95% interval kredibility je mimořádně široký (32–71%) a podpora pro klad nanduové/tinamy vylučující emu není o moc nižší (44%, interval kredibility 25–64%). Co je nejhorší, oba intervaly kredibility zahrnují i hodnotu, kterou bychom očekávali od tvrdé polytomie (hard polytomy) – tento pojem popisuje situaci, kdy se z jednoho uzlu odštěpují více než dvě větve nikoli proto, že by analýza neměla dost dat na to, aby pořadí jejich odštěpování určila, ale protože se to tak prostě opravdu stalo: z mateřské populace se simultánně oddělily více než dvě dceřinné vývojové větve. S rozřešením tvrdé polytomie nepomůže sebevětší množství dat; pokud s přidáním dalších dat ze stromu nějaká polytomie zmizí, pak nebyla tvrdá. Prakticky každý fylogenetický problém, který systematiky už opravdu dlouho otravuje, byl jednou či vícekrát označen za tvrdou polytomii; v případě ptáků to udělali Poe & Chubb (2004), podle nichž takové charakteristiky vykazuje báze kladu Neoaves (ten zahrnuje všechny ptáky mimo paleognátů, hrabavých a vrubozobých). Chojnowski et al. (2008) tento návrh vyvrátili, když ukázali, že genové stromy několika různých lokusů se navzájem shodují více, než bychom pod hypotézou tvrdé polytomie očekávali – pak by totiž byla jediným zdrojem shody náhoda. Nyní se Smith et al. (2012) paradoxně obávají toho, že Chojnowski a spol. přehlédli úplně jinou tvrdou polytomii, totiž tu u báze nepštrosích paleognátů. Nebylo by to nemožné. Délky obou problematických větví (tj. větve sjednocující tinamy s nanduy a větve sjednocující tinamy s australasijskými běžci) jsou extrémně krátké, což by odpovídalo: tvrdá polytomie má příslušné délky větví nulové.

Nejobsáhlejší z analýz provedených Smithem a spol. Použito bylo celkem 61 lokusů – 20 jaderných lokusů z analýzy Harshmana a spol. (2008), kompletní mitochondriální genomy ze studie Phillipse a spol. (2010) a 40 nových jaderných lokusů od Smithova týmu samotného. Zahrnuty rovněž byly všechny taxony použité alespoň v jedné z těchto tří analýz. Je patrné, že na výsledném stromě se opět objevil klad (tinamy + nanduové), i ten je však podložen velice slabě. Čísla kolem větví udávají v pořadí odshora dolů bootstrapové hodnoty pro: věrohodnostní analýzu dělenou do oddílů podle lokusů, věrohodnostní analýzu s jediným modelem evoluce pro celý zřetězený dataset, úspornostní analýzu; a hodnotu posteriorní pravděpodobnosti z bayesovské analýzy. "NP" znamená, že daný klad v příslušné analýze žádnou podporu nezískal. (Modifikováno ze Smith et al. 2012: Figure 4)

    Smith a spol. zde na chvíli odbočují a pokoušejí se najít jiná kritéria, podle nichž by šlo mezi alternativními hypotézami rozhodnout. Maxwell & Larsson (2009) jsou citováni jako autoři pozorování, podle nějž tinamy a emuové sdílejí ztrátu dvou konkrétních prstních článků v křídle, kterými nanduové a pštrosi stále ještě disponují. To je zajímavé (a slyším o tom poprvé, takže i příjemné překvapení), ale nic moc to neznamená. Zaprvé: pokus rekonstruovat fylogenezi paleognátů ze znaků týkajících se redukovaných předních končetin tady už byl (Bledsoe 1988), a i když dopadl zajímavě – až do analýz Grellet-Tinnera a Johnstona šlo o jedinou morfologickou studii, která vykryla sesterský vztah kiviů a kasuárovitých –, Mayr (2011) uvádí, že byl právě z hlediska volby znaků kritizován. Zadruhé, morfologických důkazů pro klad složený z tinam a nanduů je ještě daleko více. Smith a spol. sice žádné z ních necitují, ale ve starší literatuře jich lze najít hodně, dokonce tak hodně, že opět vyvolávají dojem sekundárního signálu skrytého pod konvergencemi odrážejícími nelétavost a neotenii (viz níže). Autoři naopak zmiňují, že seskupení tinam a nanduů je daleko přijatelnější z hlediska biogeografie: obě skupiny se vyskytují pouze v Jižní Americe, odkud žádného jiného žijícího paleognáta neznáme. Zároveň ale ihned uvádějí problémy tohoto argumentu: i kdyby nanduové měli k tinamám blíže než australasijští běžci, pořád k nim mají ještě blíž rovněž australasijští ptáci moa. Dodal bych ještě, že další problém vyvstává u slůvka "žijícího". Má-li Alvarenga (2010) pravdu a Diogenornis ze středního paleocénu Brazílie skutečně patří do kmenové linie kasuárovitých spíše než nanduovitých (contra Mayr 2009), pak se biogeografický argument bortí ještě důkladněji a interpretovat tinamy a nanduy jako dvě nezávislé invaze do Jižní Ameriky z Australásie by bylo přinejmenším stejně úsporné jako vydávat ptáky moa za nezávislou invazi do Australásie z Jižní Ameriky.
    Přesto je však závěr optimistický. Nepštrosí paleognáti nejspíše tvrdá polytomie nejsou, a to z jednoho prostého důvodu: ačkoli zatím nelze rozhodnout mezi sesterským vztahem tinam s australasijskými běžci a tinam s nanduy, vyloučit třetí hypotézu (tj. klad nanduů a australasijských běžců bez tinam) je až překvapivě snadné. Ve skutečnosti je podivné, jak tvrdošíjně ji data zamítají: pokud podrobíme každý z 40 lokusů samostatné bayesovské analýze a prozkoumáme obsah 95% kredibilní množiny stromů, ani v jediném případě v ní neobjevíme topologii (tinamy, (nanduové, emu)). Něco takového je s modelem tvrdé polytomie zcela neslučitelné. Špatnou zprávou je, že ačkoli je tato polytomie měkká, ani 61 lokusů s ní nepohne. Kolik s ní pohne? Těžko říct, ale autoři v této souvislosti citují nedávnou studii zaměřenou na ultrakonzervované elementy, která měla lokusů 854 (Faircloth et al. 2012).

4. Svět bez "běžců"

    V diskuzi o biogeografických a evolučních implikacích své studie se Smith et al. (2012) nepřekvapivě obhajují vícenásobnou ztrátu letu u paleognátů. Alternativní možnost, tedy jedinou ztrátu letu u společného předka paleognátů, následovanou jeho znovuzískáním u tinam, považují za nepravděpodobnou. Zatímco ptáci ztrácí let velice snadno (stalo se to hned několika taxonům nejisté fylogenetické pozice – sylviornisovi, gastornitidům a dromornitidům; vymřelým kachnám moa-nalo, drontemu, tučňákům, vymřelému ibisovi Xenicibis, alce velké, forusracidům, kakapovi, vymřelé sově Ornimegalonyx, a počet "druhů" nelétavých chřástalů se blíží dvěma tisícům [Steadman 1995]), ztráta letu a jeho opětovné nabytí nebylo zaznamenáno nikdy. Dokonce i u hmyzu je jediný navržený případ poměrně kontroverzní (Whiting et al. 2003). A pokud různé skupiny "běžců" ztratily let nezávisle na sobě, znamená to, že nezávisle vznikly i některé jejich nejtypičtější znaky. Tato konvergence je daleko patrnější v postkraniu; proto se také jediné morfologické studie podporující "běžčí" polyfylii soustředily na lebku.
    Polyfylie "běžců" také dává daleko větší volnost hypotézám vysvětlujícím jejich výskyt. Není už důvod spojovat fylogenetické divergence s rozpadem Gondwany – žádná z fylogenetických hypotéz vyjma té Johnstonovy (2011) mu stejně zcela neodpovídá, a ta Johnstonova úplné konzistence dosahuje jen za cenu rozporů s molekulárními studiemi v otázkách pozice tinam, moa a sloních ptáků. Molekulární data silně podporují hypotézu, že Nový Zéland byl paleognáty osídlen dvakrát nezávisle na sobě: jednak předky dnešních kiviů, jednak předky ptáků moa. Přestože fylogeneze sama neumožňuje vyloučit možnost, že "běžčí" evoluci tvaroval kontinentální drift, existují dva druhy důkazů svědčící o opaku.
    Kdyby tomu tak bylo, musela by se velká část paleognátí evoluce odehrát v druhohorách, neboť na rozhraní křídy a paleogénu už byly kontinenty víceméně na svých místech. Pak je ale podezřelé, že téměř všechny paleognátí fosilie známe až z kenozoika. Hope (2002) ukázala, že většina mezozoických ptáků pokládaných aspoň čas od času za paleognáty buďto nejsou ptáci (Wyleyia), nejsou součástí ptačího korunního kladu (Ambiortus, Gansus), nebo jejich paleognátí status není možné přesvědčivě podpořit (Palaeocursornis). Nejstarší paleognátí fosilie, "litornitidi" ze souvrství Hornerstown (Parris & Hope 2002), pocházejí buď z nejpozdnější křídy, nebo nejstaršího paleogénu. Přítomnost odvozených vrubozových typu vegavise ve svrchnokřídových vrstvách a také všechny studie používající molekulární datování jednoznačně říkají, že nějací paleognáti v druhohorách být museli. Jak ale podotkli Houde & Haubold (1987), pokud by to skutečně měli být velcí "běžci" dnešního typu, pak bychom už nějaké měli znát, protože jejich velké, masivní, nepneumatizované kosti jsou při fosilizaci oproti pozůstatkům létajících ptáků ve výhodě. Krom toho známe z paleogénu Evropy a Severní Ameriky řadu paleognátů, nelétavých (Palaeotis) i létavých (Lithornithidae), kteří se sem museli nějak dostat. Smith et al. (2012) navrhují, že hypotéza o aktivním rozptylu přes oceán kombinovaném s několika oddělenými ztrátami letu dovede tento fakt vysvětlit lépe než jediný vznik nelétavosti s následnou vikariancí, který preferují zastánci "běžčí" monofylie. Odkazují na Houde'a (1988), podle nějž byli litornitidi zdatní letci schopní překonat oceán. Druhým důkazem pro to, že evoluce paleognátů s rozpadem Gondwany příliš nesouvisela, jsou podle Smithe a spol. molekulární hodiny, které ukazují, že data divergencí v rámci paleognátů jsou podstatně mladší než data separací jednotlivých pevnin z mateřského superkontinentu.
    Zdá se tedy, že nám všem, kdo jsme si užívali "epyornisovu povídku" z Dawkinsova Příběhu předka (Dawkins 2004), zbydou jenom oči pro pláč. (Je to mimochodem už podruhé, co v článku do téhle knížky rýpu. Měl bych své oblíbené čtivo roztrhat a spálit?) Skvěle to pojmenovali Harshman s kolektivem: představa "běžců" postupně se vzdalujících svým příbuzným tak, jak je na obrovských "vorech" unáší nemilosrdný kontinentální drift,
should be viewed as yet another example of the phenomenon that Huxley called ‘‘the great tragedy of science—the slaying of a beautiful theory by an ugly fact.’’

Harshman et al. 2008:13466
5. Budoucnost a úloha morfologie

    Smith a spol. už nevidí velký důvod, proč se nadále zabývat fylogenetickými hypotézami odporujícími monofylii nepštrosích paleognátů. Je pravda, že pro hypotézu monofylie "běžců" sice mluví mnoho analýz morfologických (Mayr & Clarke 2003; Livezey & Zusi 2007; Worthy & Scofield 2012) i molekulárních (Sibley & Ahlquist 1990; García-Moreno & Mindell 2000; Haddrath & Baker 2001) dat, a dokonce ani protikladná evidence ze strany mitochondriální DNA (Phillips et al. 2010) nemusí být průkazná: autoři připomínají, že 37 genů v mitochondrii díky fyzickému propojení reprezentuje jediný "superlokus", takže případný konflikt mezi genovým a druhovým stromem by zůstal neodhalen, a že fylogenetické analýzy mtDNA jsou velice citlivé na taxon sampling a volbu substitučního modelu. Teprve fakt, že Smith et al. (2012) dokázali se zcela nezávislým datasetem dorazit k úplně stejným výsledkům jako Harshman et al. (2008), dává polyfylii "běžců" a monofylii nepštrosích paleognátů náležitou váhu. Ukazuje, že tyto výsledky odrážejí signál rozložený po celém jaderném genomu – ne jenom jedinečné vlastnosti konkrétního datasetu – a nasazení sofistikovaných metod vylučuje možnost, že by za nimi stál jakýkoli známý zdroj nehistorických signálů.
    Ponechává tento úspěch molekul prostor pro morfologii? Autoři proto navrhují, aby se budoucí morfologické studie podrobněji zaměřily na rozdíly v ontogenezi jednotlivých "běžců", které by mohly objasnit, jakými mechanizmy tito ptáci dorazili k tak podobnému tělnímu plánu. Stejně tak adaptace na rychlý pohyb po zemi, které daly "běžcům" jejich české jméno, zřejmě vznikly několikrát nezávisle na sobě modifikací tělního plánu silného letce podobného fosilním litornitidům – na tento proces by mohly vrhnout světlo biomechanické studie. Ani slovo ovšem nezaznělo o tom, že by morfologická data mohla pomoct v dalším výzkumu paleognátní fylogeneze. Je zcela očividné, že představují jediný způsob, jak se můžeme něco dozvědět o pozici paleognátních fosilií typu paleotida, diogenornise, eleuterornise, remiornise a četných "litornitidů", kteří jsou stále intenzivněji podezíráni z para- či poly- fylie (Houde 1988; Mayr 2009; Phillips et al. 2010). Postavení těchto taxonů je přitom zajímavé i pro neontology: může pomoct s datací jednotlivých divergencí.
    Paleontolog Gerad Mayr ve své skvělé revizi ptačí fylogeneze (Mayr 2011) uznal, že molekuly pomohly v mnoha oblastech, kde morfologie selhala, a že velké datasety sekvenčních dat vykazují daleko příznivější poměr signálu k šumu než srovnatelně rozsáhlé datasety morfologické. Zároveň však učinil i kontroverzní argument, podle nějž se čas od času situace obrací a je to anatomie, která pomáhá rozřešit příbuzenské vztahy i tam, kde molekulára selhala. Jako hlavní příklad takového fenoménu nabídl příbuzenské vztahy uvnitř kladu Strisores ("lelci" včetně svišťounů), což při pohledu zpět nebyla úplně šťastná volba: Mayr zde hodně věřil své dřívější morfologické analýze (Mayr 2010), jejíž výsledky ale zanedlouho po publikaci jeho revizní studie překopali Nesbitt et al. (2011) – je ironické, že své výsledky shledali právě tak robustními jako Mayr (2010) ty svoje. Nešťastně zvolený příklad ale nevyvrací pointu, a je zde lákavá možnost, že morfologie by mohla molekulám pomoci i v jediném zbývajícím otazníku mezi příbuzenskými vztahy žijících paleognátů, totiž s postavením tinam. Je až překvapivé, kolik lze najít znaků spojujících tinamy s nanduy a separujících výslednou skupinu od všech ostatních (žijících) paleognátů, podíváme-li se do literatury dostatečně staré a/nebo obskurní. Ideálním místem, kde začít s hledáním, jsou tak Sibley & Ahlquist (1972), jejichž třísetstránková revize zmiňuje prakticky všechny fylogenetické hypotézy od roku 1800.
    Nejsilnějším důkazem pro to, že "běžci" jsou polyfyletickým seskupením v rámci monofyletických paleognátů, je silná molekulární podpora pro skupinu tvořenou všemi paleognáty mimo pštrosů; morfologové se však ke stejné hypotéze nejvíce přiblížili úvahami o podobnostech nanduů a tinam. Beddard (1910) je zaznamenal v trávicím traktu: variace v rámci "Struthiones" podle něj byla vyšší než u mnoha jiných skupin ptáků, ale "possible likeness between Crypturus and Rhea" zmiňuje jako jeden z "certain classificatory results [that] seem to follow from a comparison of the differences exhibited by the intestinal tract" (Beddard 1910:89). Je pravda, že Sibley & Ahlquist (1972) právě na základě Beddardovy klasifikace usoudili, že taxonomická hodnota střevních kliček je prakticky nulová, ale nejde o jediný znak mířící tímto směrem. McDowell (1948) je citován především pro svůj poznatek, že paleognátní stavbu kostěného patra – od dob Huxleyho nejoblíbenější a nejpřesvědčivější znak sjednocující "běžce" navzájem a s tinamami – není možné uspokojivě definovat. Zastánci polyfylie "běžců" a paleognátů typu Mayra nebo Wetmore'a se tohoto zjištění sice rychle chopili, jak ale poznamenávají Sibley & Ahlquist (1972), téměř nikdy neuvedli, že McDowell v rámci paleognátů rozeznal několik skupin, které považoval za monofyletické. Výše citovaným seskupením sloních ptáků a kiviů si nebyl jist, našel však zarážející počet podobností nanduů s tinamami. U obou skupin spolu obě kosti předradličné (prevomery) nedokonale srůstají do velkého nepárového elementu s výraznou "vidlicí" na přední i zadní straně; zadní část horního okraje kosti patrové zespodu vybíhá kousek pod boční okraj zadního konce předradličné kosti a srůstá s ním. Tinamy i nanduové dále sdílí uspořádání patra, v němž kost křídlová (pterygoid) seshora nasedá na prevomer a následně se stáčí dozadu a ven, kde se připojuje na kost patrovou. To je odlišuje od pštrosů (kde křídlová kost nekontaktuje ani prevomer, ani patrovou kost), kasuárovitých (křídlová kost kontaktuje pouze prevomer) i kiviů a sloních ptáků (kde pterygoid kontaktuje předradličnou i patrovou kost najednou, nikoli postupně). Autor dokonce uvádí, že:
The similarity of the palate of the Rheidae to that of the Tinamidae is also borne out by similarities in the nasals, lacrymals, calvarium, costal processes, hypotarsus, sculpture of leg-bones, coiling of gut, etc. This resemblance is so great, in fact, that close phylogenetic relationship seems unavoidable.

McDowell 1948:540
A dále v textu:
It would also seem wise to simplify the classification of this group by the merging of certain orders which seem, on the basis of palatal pattern, to be closely related. Thus:
Order Tinamiformes to include the Rheidae in addition to the tinamous, thus eliminating the order ‘Rheiformes’ from the list.

McDowell 1948:547
    Je pravda, že korespondence mezi McDowellovými závěry a výsledky molekulárních fylogenetických analýz není úplná. Ptáky moa nezařadil do stejné skupiny jako tinamy a nanduy; místo toho je připojil ke sloním ptákům a kivům pod Apterygiformes. (Stojí ovšem za zmínku, že právě ptáci moa se mu z diagnózy skupiny nejčastěji vymykali.)

Kostěné patro nandu pampového (Rhea americana, A) a tinamy inambu (Rhynchotus, B) při pohledu seshora (vlevo) a zespoda (vpravo). Oba taxony v této oblasti sdílí řadu znaků, které u jiných paleognátů nenacházíme – zvláštní skloubení kosti křídlové s kostí předradličnou a kostí patrovou, morfologii předradličné kosti a tvar bazipterygoidních a parasfenoidních výběžků. Většina rozdílů je pouze zdánlivá a způsobená tím, že patro tinam je delší a užší. Význam zkratek: (bp) bazipterygoidní výběžek, (mp) patrový výběžek maxilly, (p) kost křídlová, (pa) kost patrová, (pm) předčelistní kost, (pv) prevomer, (ps) parasfenoid, (q) kost čtvercová. (Modifikováno z McDowell 1948: Text-figs. 1 a 2)

    Verheyen skutečnost, že "[l]es nandous (Rheiformes) sont apparentés aux tinamous", dokonce konstatoval přímo v titulku jedné ze svých četných studií (Verheyen 1960a). V ní shrnuje morfologické znaky nasvědčující tomu, že nanduové mají blíž k tinamám než k africkým pštrosům (McKinney 1961). Příliš ovšem nepomáhá, že ještě tentýž rok publikoval studii, která naopak argumentovala pro zařazení tinam do hrabavých (Verheyen 1960b).
    Parkes & Clark (1966) věřili, že tinamy reprezentují morfologicky nejméně odvozené zástupce paleognátů (což se vzhledem k jejich schopnosti letu zdá být rozumné), a navrhli, že jednotlivé linie "běžců" se vyvinuly z "čeledi" jakýchsi proto-tinam několika nezávislými ztrátami letu. Takový scénář perfektně odpovídá tomu, co navrhují Harshman et al. (2008) a Smith et al. (2012); jediný rozdíl je v tom, že Parkes a Clark neměli explicitní fylogenetickou hypotézu, kterou by ho podložili. Opět však měli co říct k nanduům a tinamám:
The situation in the New World is particularly interesting. It appears reasonable to assume that the rheas, of all of the large flightless birds, have attained the “ratite grade” most recently. Their wings are the least reduced, and they show many resemblances to tinamous, leading McDowell ( 1948) to combine the Rheidae and Tinamidae into a single order. It seems to us to be probable that the rheas evolved flightlessness in South America, possibly from ancestors appreciably nearer the tinamou than the proto-tinamou level. Thus they retain ancestral characteristics common to the whole group (cf. the rhamphothecal structure), but share certain special characteristics with the only other New World group, the tinamous.
Parkes & Clark 1966:468
    Jehl (1971) zkoumal barevné vzorce v prachovém peří mladých paleognátů a dospěl k závěru, že tinamy nemají v tomto ohledu s "běžci" prakticky nic společného. Zajímavější je však jeho zmínka o tom, že "[t]he attempt to establish a phylogenetic link between the ratites and tinamous, and  particularly between the rheas and tinamous, dates at least to the early 19th century, and the downy young have been used to give some support to that view." (Jehl 1971:300). Sám autor přiznal, že ačkoli jeho data takové příbuzenství nepodporují, nestačí k tomu, aby mohlo být zamítnuto. Klad (nanduové + tinamy) vyčetli z jazykového aparátu i Bock & Bühler (1990), jejichž pětistránkový abstrakt v obskurním sborníku stál za zrodem dnešní podoby hypotézy o "běžčí" polyfylii (viz přechozí díl článku). Tomlinson (2000) mnohá pozorování Bocka a Bühlera opravila a jejich závěry kritizovala – místo toho přišla s vlastní, o nic méně revoluční hypotézou, podle níž monofyletičtí "běžci" tvoří sesterskou skupinu ke kladu složenému z tinam a neognátů. I tak ale ve své práci uvedla četné podobností tinam a jejich jihoamerických příbuzných: tvar jazyka i charakteristiky jazykové sliznice jsou u obou taxonů v podstatně shodné a paraglossale (chrupavčitá součást jazylky, viz minulý článek) některých tinam je dokonce podobnější témuž elementů u nanduů než u jiných tinam. Podobnosti vykazuje i vnější jazylkojazykové svalstvo. Zatahování jazyka je u nanduů i tinam realizováno nepřímým působením svalů na jazylkové rohy, zatímco u emu jiná sada svalů působí přímo na ceratobranchiály a urohyale a u pštrosa přímo na ceratobranchiály a hrtan (Tomlinson 2000:379).
    Jelikož nepštrosí paleognáti nejsou tvrdá polytomie, vztahy tinam dříve či později odhalíme – jen budeme muset identifikovat a osekvenovat potřebné desítky (či lépe stovky) nových vhodných lokusů. Výše uvedené studie se ale zdají napovídat, že existuje i jednodušší cesta, totiž detailní fylogenetická analýza lebečních a měkkotkáňových znaků, které ornitologové za poslední století dokázali nashromáždit.

6. Acknowledgments

    Děkuji Janu Zrzavému za přístup k fulltextu studie Smithe a kolektivu, Nicolási Diezovi za přístup k řadě dalších prací zmiňovaných v tomto článku, a Alexanderu Suhovi za to, že mě upozornil na abstrakt Bakera a Haddratha.

Zdroje:

    Proč neexistují "běžci" (Ratitae), díl 1. – co DNA skrývala a morfologové přehlíželi

    Viz také:

        Je to skoro trapné, ale už jsem zase jednou blog bez přijatelné výmluvy zanedbával – dvoutýdenní pobyt v Krasiejowě by sice přijatelný byl, ale už jsem přece jen měsíc zpátky. Pauzu tedy zakončuji s článkem o historickém vývoji hypotéz o "běžčí" polyfylii: tyto nepodložené spekulace systematiků nezdravě posledlých konvergentní evolucí byly nedávno částečně – a zcela nečekaně – oživeny pokroky v molekulární fylogenetice. Mělo jít původně o součást připravovaného článku o nové studii, která tento pohled dále potvrzuje, jenže podkapitola "historický úvod" zbytek článku jaksi přerostla, a tak ji předkládám samostatně.

    Názvoslovná poznámka: nemá cenu skrývat to až na konec článku, už jsem to stejně vyzradil v nadpisu a pak pro jistotu ještě jednou v prvním odstavci: podle nejlepších současných poznatků jsou "běžci" umělá, reálně neexistující skupina, a tak jsou v textu důsledně uvozovkováni. Výjimkou je spojení "australasijští běžci", které naopak označuje zcela bezproblémovou skupinu přirozenou. V tomto sousloví  dané slovo do uvozovek nedávám, ale to jen proto, že jím neodkazuji k nějaké podmnožině "běžců" jako takových, nýbrž k samostatné skupině, pro níž náhodou žádné lepší jméno nemám.

    1. Jak "běžci" fascinují frustrují systematiky

        "Běžci" jsou bezesporu jednou z nejcharizmatičtějších skupin ptáků. Při pohledu na pštrosa či nandu snad ani nepřekvapiví, že až do 80. let minulého století se historií táhla téměř nepřetržitá linie autorů, kteří "běžce" považovali za zakonzervovanou větev dinosaurů, kteří se nikdy nenaučili létat a svůj původ odvozovali z úplně jiné skupiny teropodů než létaví "karináti" (Lowe 1935; Oliver 1945; Holmgren 1955; Glutz von Blotzheim 1958, 1960; Verheyen 1961; Friant 1968; Barsbold 1983). Embryologická pozorování, stejně jako nespočet podobností ve stavbě křídla a přítomnost pygostylu, takovým spekulacím sice učinila přítrž, přesto se ale od "běžců" stále můžeme dozvědět leccos o dinosauří reprodukční biologii (Varricchio et al. 2008) či metabolizmu (Erickson et al. 2009). Stále také platí, že kasuár a jeho téměř dromeosauridí nohy či nandu, který jinak zcela normálními křídelními drápky disponuje na každém ze tří prstů, jsou nejbližší připomínkou neptačích dinosaurů, jakou v dnešním světě dostaneme.


    Darren Naish nedávno u příležitosti vydání druhé edice The Complete Dinosaur na DeviantArtu zpřístupnil své skvělé kresby z kapitoly o moderních ptácích, kterou se mu tam povedlo dostat (kéž by takových knih bylo víc!). Zde tedy stylově seskupení žijících a fosilních paleognátů. (A) kasuár přilbový, Casuarius casuarius; (B) kasuár jednolaločný, Casuarius unappendiculatus; (C) hnědý kivi, Apteryx; (D) kivi Owenův, Apteryx owenii; (E) moa Pachyornis elephantopus; (F) moa Euryapteryx geranoides, detail na hlavu; (G) sloní pták Aepyornis maximus. Kredit: Darren Naish; obrázek použit v souladu s licencí Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0.

        Na druhou stranu "běžce" už od jejich rozeznání v 1. polovině 19. století provází stín pochybností. Jde opravdu o přirozenou skupinu? Sdílejí všichni "běžci" jediného společného předka, který současně nebyl předkem žádného dalšího žijícího ptáka? Pokud ano, dokázal tento předek létat, nebo už schopnost letu ztratil, tak jako jeho dnešní potomci? A pokud byl nelétavý, jak lze tuto skutečnost sladit s pozoruhodným faktem, že všichni známí "běžci" – včetně těch subfosilních, jako jsou ptáci moa nebo sloní ptáci z Madagaskaru – se vyskytují výhradně na pevninách jižní polokoule? Samotné vědecké jméno "běžců", "Ratitae", odkazuje na plochou hrudní kost, postrádající kýl pro úpon masivních létacích svalů, tak typických pro všechny ptáky, a připomínající tak svým tvarem vor (ratis). Přestože většině nelétavých ptáků tento kýl zůstal a jeho absence se nezdála být špatným spojujícím znakem, toto pravidlo neplatí absolutně. Dromornitidi, podivná skupina až půltunových australských ptáků; Gastornis, další nelétavý obr snad blízce příbuzný vrubozobým; Patagopteryx, druhohorní pták stojící mimo ptačí korunní klad (Neornithes); a havajské husám podobné kachny moa-nalo – ti všichni kýl na prsní kosti ztratili také (Chiappe 2002), a přestože některé z těchto taxonů s "běžci" skutečně spojovány byly, třeba výše zmíněné kachny lze tímto způsobem odvysvětlit dost těžko. Podobností mezi těmito taxony a "běžci" je víc: zmenšení rozměrů a počtu křídelních kostí, redukce či ztráta kosti vidličné (furkuly), srůst lopatky a krkavčí kosti do skapulokorakoidu, protažení ilioischiadického otvoru (= prostoru mezi srostlou kostí kyčelní a sedací) v pánvi a zesílení kostí zadních končetin (Houde 1988; Chiappe 2002; Harshman et al. 2008). Pokud se všechny tyto znaky vyvinuly několikrát nezávisle na sobě, můžeme si být jisti, že zrovna v rámci "běžců" se tak stalo pouze jednou?
        Jedním z prvních pochybovačů o monofylii "ratitů" byl Owen (1866), známý coby autor jména Dinosauria a (blíž k tématu) průkopník výzkumů ptáků moa. Owen byl paradoxně jedním z posledních, kdo tyto pochybnosti doprovodil nějakou explicitní alternativní hypotézou, tzn. uvedl, komu jsou podle něj jednotliví "běžci" nejblíže příbuzní, když už ne k sobě navzájem. Jak ukázali Sibley & Ahlquist (1972), pštrosy (Struthio) Owen spojil s dropy (Otididae), kivi a moa (Apteryx, Dinornithidae) s tabonovitými (Megapodidae). Huxley (1867) ve své klasifikaci řadil všechny "běžce" do jediné skupiny, kterou navíc postavil na roveň všem ostatním ptákům dohromady, jinak jsou ale jeho názory na afinitu "běžců" spíše nejasné. Považoval je za zbytky kdysi rozsáhlé skupiny, která tvořila mezičlánek mezi dinosaury a létavými ptáky, což příliš nezní jako argument pro jejich monofylii. Tento Huxleyho pohled formalizoval Fürbringer (1888), když na svém fylogenetickém stromě usadil "běžce" na čtyři oddělené větve různě vzdálené od zbytku ptáků. Jedna z těchto větví, Alectorornithes, zahrnovala i létavé tinamy. Přestože Huxley a Fürbringer bývají citováni jako zastánci protikladných názorů na "běžčí" původ (Sibley & Ahlquist 1972), ve skutečnosti si docela dobře odpovídají. Huxley viděl "běžce" jako "basal stock", z níž vzešli všichni létající ptáci, a Fürbringer je tak zakreslil na strom – "běžci" jsou tam parafyletičtí vůči všem létavým ptákům mimo archeopteryga. (Na druhou stranu ale řada druhotných zdrojů uvádí, že podle Fürbringera se "běžčí" charakteristiky vyvinuly několikrát nezávisle na sobě a nebyly zděděné od společného nelétavého předka. To by znamenalo "běžčí" polyfylii, nikoli parafylii, a odporovalo tedy Huxleyho pohledu. Nemění to ale nic na tom, že ani na Huxleyho nelze pohlížet jako na bezvýhradného zastánce "běžčí" monofylie.)
        Spor mezi zastánci "běžčí" monofylie a polyfylie trval dlouho. Monofylii obhajovali Mivart (1877), Gadow (1893), Beddard (1898) nebo Clark (1901); polyfylii Parker (1895), Pycraft (1900), Stresemann (1927–34) nebo Wetmore (1930). Zastánci polyfylie považovali za podporu pro svou hypotézu embryologické studie, které dokumentovaly četné podobnosti mezi "běžci" a "karináty": např. palec na noze, který je u dospělých "běžců" buď ztracen, nebo – u kiviho – orientován anteromediálně, podobně jako u neptačích teropodů; je u "běžčích" embryií je přítomen a obrácen dozadu stejně jako u normálních ptáků. Tvrdou ranou pro "běžčí" monofylii byla studie McDowella (1948), který ukázal, že paleognátní či dromeognátní typ kostěného patra, okouzlující systematiky už od dob Huxleyho, není možné uspokojivě definovat a sestává ve skutečnosti ze čtyř odlišných morfotypů, charakteristických pro 1) pštrosy, 2) tinamy a nanduy, 3) kivie, moa a snad i sloní ptáky a 4) kasuáry a emu. Mayr & Amadon (1951:4) už konstatovali, že: "the present consensus is that the main groups of these birds are of independent origin." Vše dovedl do konce de Beer (1956), který poskytl přijatelný mechanizmus vysvětlující, proč bychom měli u zcela nepříbuzných skupin ptáků pozorovat tak obrovské množství konvergence. Mělo jít o neotenii, tedy uchování znaků typických pro mláďata do dospělosti. Neotenie dokázala vysvětlit prakticky všechny navrhované znaky sjednocující "běžce", od struktury peří po stavbu kostěného patra. Paradoxní je, že ačkoli právě tehdy dosáhla obliba hypotézy "běžčí" polyfylie vrcholu, ornitologové zcela rezignovali na pokusy určit, které skupiny ptáků mají k jednotlivým "běžcům" nejblíže. Jak ukázali Cracraft et al. (2004), Mayrův zájem o speciaci a populační genetiku zabil jakékoli pokusy o velkoškálovou ptačí fylogenetiku. Wetmore'ovy klasifikace, které tomuto období dominují, jsou kompletně odvozeny od autorů z 19. století; přes Gadowa je lze vysledovat až k Fürbringerovi.
        Období beznaděje však netrvalo dlouho. Dostupnost molekulárních dat a vznik numerické fylogenetiky nejenže obnovily zájem o ptačí fylogenezi, ale také vzkřísily "běžčí" monofylii. Sibley (1960) elektroforézou proteinů z vaječných bílků prokázal blízkou příbuznost kasuárů, emu a pštrosů, byť v případě nanduů raději vyčkával na více dat. Bock (1963) přezkoumal McDowellovy závěry a podpořil "běžce" coby přirozenou skupinu na bázi osteologie. Meise (1963) totéž učinil na základě behaviorálních dat; nejenže spojil "běžce" spolu navzájem a s tinamami, ale neshledal jejich rozdíly o nic většími, než jsou ty v rámci hrabavých. Brzy následoval příval nových důkazů pro "běžčí" monofylii ze studií zkoumajících elektroforézu proteinů z vaječných bílků (Miller & Feeney 1964; Osuga & Feeney 1968), ramfotéku (Parkes & Clark 1966), karotické tepny (Baumel & Gerchman 1968), spermie (McFarlane 1971), mikrokomplementární fixace transferinu a sérového albuminu (Ho et al. 1976; Prager et al. 1976; Prager & Wilson 1980), DNA-DNA hybridizaci (Sibley et al. 1981, 1985) a aminokyselinové sekvence bílkovin z oční čočky (Stapel et al. 1984). Cracraft (1974) pro zastánce "běžčí" monofylie přivlastnil dřívější de Beerovy argumenty pro neotenii – pro něj neotenie představovala jen mechanizmus, kterým "běžci" přišli k odvozeným znakům, které podporují jejich monofylii. Zároveň přišel s mimořádně lákavou myšlenkou, podle níž může být geografický výskyt "běžců" vysvětlen skrze rozpad Gondwany (Cracraft 1973), čímž spustil sérii horečnatých pokusů naroubovat každou novou fylogenetickou hypotézu na pořadí, v němž se dnešní pevniny odštěpovaly z bývalého superkontinentu. Tato kratochvíle ornitology nepustila dodnes (Bourdon et al. 2009; Phillips et al. 2010; Johnston 2011) a co hůř, vstoupila do učebnic jako klasický případ vikariantní biogeografie (Gill 2007).
        Je pozoruhodné, jak málo se grandiózní spor o existenci "běžců" dotkl tinam. Tato skupina neotropických, nepříliš dobře létajících ptáků značně připomínajících vnějším vzhledem hrabavé, byla s "běžci" spojována od raného 19. století. Parker (1864) postřehl, že se jejich kostěné patro nápadně podobá tomu "běžčímu". Huxley (1867), který svou klasifikaci na kostěném patře založil, se tento postřeh rozhodl ignorovat a tinamy zařadil spolu se všemi ostatními non-"běžci" do "Carinatae" (na základě přítomnosti kýlu na hrudní kosti, tedy primitivního znaku), alespoň ale podotkl, že jde o "the most struthious of all carinate birds" (Huxley 1867:426). Následující autoři tak konzervativní nebyli a do svých klasifikací často zahrnuli skupinu, která v sobě "běžce" a tinamy kombinovala, přestože jména jí dávali různá (Garrod 1874 – Struthiones; Stejneger 1885 – Dromaeognathae). Tím jménem, které přežilo do dnešní doby, se náhodou stalo Palaeognathae od Pycrafta (1900). Je to trochu paradoxní, neboť Pycraft nebyl na rozdíl od Garroda a Stejnegera přesvědčen, že pojmenovává monofyl. Jak napovídá etymologie jména (palaios – starý; gnathos – čelist), skupinu vědomě vztyčil na základě primitivního znaku (resp. se domníval, že jde o znak primitivní: to, zda je primitivním stavem paleognátní patro, neognátní patro, nebo ani jedno, je dalším z únavných ornitologických sporů), byl však přesvědčen, že dělení založené na stavbě patra je stále lepší, než dělení postavené na sternálním kýlu, který mohl být ztracen několikrát nezávisle na sobě (viz výše).
        Prakticky všichni předpokládali, že mono- či poly- fyletické jsou vždy obě skupiny současně: s nějakou kombinací "běžčí" monofylie a paleognátní polyfylie či monofyletických paleognátů a polyfyletických "běžců" přišlo překvapivě málo autorů. Dokonce i jedna z nejzajímavějších hypotéz, s níž přišel Pycraft (1900) sám, tuto nudnou dichotomii respektovala. Pycraft si své paleognáty představoval coby polyfyl složený ze dvou přirozených podskupin: jedna měla zahrnovat nandu, tinamy, sloní ptáky a moa s kivii, druhá emu, kasuáry a pštrosy. "Běžci" buď byli viděni jako přirozená skupina, jejímž sesterským taxonem jsou tinamy v rámci monofyletických paleognátů (Bock 1963; Parkes & Clark 1966; Osuga & Feeney 1968; Cracraft 1974; Prager et al. 1976; Prager & Wilson 1980; Sibley et al. 1981, 1985), nebo jako polyfyletické uskupení nepříbuzných linií neognátů, které díky neotenii a společnému způsobu života konvergují na stejné morfologii (a konvergují na ní tak dobře, že ani nepoznáme, které že linie neognátů to vlastně jsou*), v kterémžto případě pak tinamy vždy neomylně zamířily do blízkosti hrabavých (Seebohm 1888; Beddard 1910; Verheyen 1960, 1961; Gysels 1970). Až v 60. letech se s oživením monofylie "běžců" na základě molekulárních (či, jak se tehdy říkalo, biochemických) dat začaly objevovat návrhy na oživení staré, před-pycraftovské dichotomie "Ratitae"/Carinatae. Řada studií byla schopna potvrdit monofylii "běžců", už ale ne jejich blízký vztah k tinamám, či přímo naznačovaly příbuznost tinam a hrabavých – to se týká studií vaječných bílků (Sibley & Ahlquist 1972; Sibley & Frelin 1972), osteologických a paleontologických dat, především těch od litornitidů (Houde 1988), délkových rozdílů v ribozomální DNA (Mindell & Honeycutt 1989) a fylogenetické analýzy mitochondriální 12S rRNA (Cooper et al. 1992).

    *Jediným, kdo se namáhal aspoň trochu upřesnit, z kterýchže neognátů by měli být jednotliví "běžci" odvozeni, byl Olson (1985). Podle něj jsou žijící pštrosi (Struthio) blízce příbuzní středoasijským taxonům Eogrus a Ergilornis, které s ním sdílejí na ptačí poměry unikátní dvouprsté nohy a Olsonovi se zdály být ve správnou dobu na správném místě. Snad ale není třeba dodávat, že numerická fylogenetika toto příbuzenství nepotvrdila: Clarke et al. (2005) ukázali, že eogruidi mají blízko k jeřábům.

        Hypotézy o non-monofylii paleognátů zhynuly zaslouženou smrtí s tím, jak se systematikové přesunuli od proteinů k sekvenování mitochondriální a jaderné DNA. Ani to se sice neobešlo bez komplikací (hybridizační studie shlukovaly paleognáty s hrabavými a vrubozobými do "Eoaves", sekvenční analýzy mtDNA s malým taxon samplingem odkrývaly pěvce nebo dokonce jen zpěvné jako sesterskou skupinu všech ostatních ptáků a fakticky tak zanořovaly paleognáty do Neognathae). Na přelomu devadesátých a nultých let už však bylo jasné, že paleognáti jsou monofyletičtí a tvoří sesterskou skupinu ke všem ostatním žijícím ptákům (Groth & Barrowclough 1999; García-Moreno & Mindell 2000). Boje se mezitím přesunuly na vzájemné příbuzenské vztahy mezi "běžci": molekulára se nemohla rozhodnout, zda na bázi patří pštrosi, nanduové nebo klad (pštrosi + nanduové), zatímco morfologie tam tvrdošíjně umisťovala kivie, kteří podle molekul tvoří sesterskou skupinu kasuárovitých. Takové spory jsou však neobyčejně nudné, a tak to nemohlo dlouho zůstat.

    2. Kde jsme teď

        Zároveň se v 90. letech vyskytly dvě zapadlé práce, které si ušlechtile předsevzaly najít dosud nevyzkoušený zdroj dat, který by šlo k rozřešení vztahů mezi paleognáty použít. Úkol to byl nelehký a nezáviděníhodný, neboť jak výborně shrnul Houde (1988; Houde & Haubold 1987), tou dobou už ornitologové vyčerpali fylogenetický potenciál kostěného patra, křídlových svalů, ramenního i pánevního pletence, mikrovaskularizace kostní tkáně, osteologie kotníku, myologie křídel, ramfotéky, tělních dutin, kardiovaskulární soustavy, pterylografie, opeření mláďat, gonád, spermií, Fabriciovy burzy (pokud jste o takovém orgánu neměli ani ponětí, jsme dva), Eustachovy trubice, kortikální neuroanatomie, karyologie, proteinů vaječného bílku, proteinů oční čočky, chování a parazitů. Přesto se zadařilo: Bock & Bühler (1990)* – mezi autory byl i Walter Bock, který monofylii "ratitů" v 60. letech pomáhal oživit – prozkoumali paleognátí jazylkový aparát, Elżanowski (1995) mozkovnu a patro. Nezávisle na sobě konečně přišli s poslední možnou kombinací, totiž že paleognáti monofyletičtí jsou, ale "běžci" ne.

    *Zatímco většina zdrojů cituje tuto studii s rokem 1990, Johnston (2011) s rokem 1988. Snad je to tím, že sympozium, z něhož pochází, se sice skutečně konalo v roce 1988, ale sborník z něj vyšel až o dva roky později. Bock sám, který by to snad měl vědět nejlépe, tuto práci cituje s rokem 1990 (Bock 2003).

        Nikdo z nich své závěry nepodložil numerickou analýzou a mohlo by jít jen o další zajímavý příspěvek do sbírky podivných hypotéz, kdyby si jejich závěry nebyly tak pozoruhodně podobné: jak Bock s Bühlerem, tak Elżanowski dospěli k tomu, že sesterským taxonem vůči všem ostatním paleognátům nejsou tinamy, ale pštrosi (Struthio). Zatímco Bock a Bühler ukázali, že tinamy a nanduové sdílí specifickou stavbu jazylky a přilehlého svalstva, kterou nenajdeme ani u pštrosů, ani nikde jinde (viz níže), což je sice zajímavé, ale ne nutně informativní, Elżanowski zdokumentoval velké množství znaků, v nichž je pštros buďto pleziomorfický, nebo přechodný mezi neognáty a zbývajícími paleognáty. Palatální výběžky předčelistní kosti, které jsou u všech ostatních paleognátů velice výrazné a které se kloubí s kostí radličnou, mají pštrosi menší; postranní výběžek kosti patrové je malý až zakrslý u neognátů, střední u pštrosa a velký u ostatních paleognátů. Prostřední z výběžků maxilly, které se kloubí s kostí patrovou (tzv. maxillopalatinální výběžek), u neognátů a pštrosů odděluje tělo maxilly od kosti radličné, zatímco u nepštrosích paleognátů je zakrslý nebo zcela chybí. Neognáti a pštrosi mají maxillu srostlou s předčelistní kostí, zatímco u jiných "běžců" a tinam jsou obě kosti spojeny jen vazivově. Tento znak je primitivní a neognáti i pštrosi mohli jeho odvozený stav vyvinout nezávisle na sobě, stejně tak je ovšem možné, že jde u nepštrosích paleognátů o odvozený návrat k původnímu stavu a tedy platný sjednocující znak (Elżanowski 1995).
        Zatímco na obě práce bylo rychle zapomenuto a state-of-the-art molekulární studie už se v předních žurnálech přely výhradně o topologii báze "běžců" a pozici ptáků moa (Cooper et al. 2001; Haddrath & Baker 2001), několik molekulárně-biologických laboratoří z celého světa se spojilo pod vedením velkého zastánce "běžčí" monofylie J. Cracrafta, aby předložilo výsledky svých čerstvě dokončených rozborů dosud neanalyzovaných genů (Cracraft et al. 2004). Vynecháme-li z diskuze stromy s velkými polytomiemi, na všech výsledných kladogramech byli přítomní monofyletičtí paleognáti a na většině z nich monofyletičtí "běžci". Na jednom však ne. Konsenzový strom vzešlý z úspornostního bootstrapu 1100 bází jaderného onkogenu c-myc (Cracraft et al. 2004: Figure 27.4) neukazoval "běžce" jako monofyletické – a, co je ze všeho nejzajímavější, u báze paleognátů v této topologii opět stál pštros. 1100 bází je samozřejmě málo oproti studiím založeným na kompletních mitochondriálních genomech (okolo 13 500 bází), ale jaderné geny jsou obecně považovány za spolehlivější pro odkrývání hlubších příbuzenství, jelikož nepodléhají tak rychle saturaci (ztrátě fylogenetického signálu). Navíc šlo už o třetí dataset, který odkryl stejný výsledek, což vyvolává neodbytnou představu sekundárního signálu, skrytého pod nánosem dat podporujících sesterský vztah tinam a monofyletických "běžců". Autoři sami podotkli, že "single gene trees often do not recover ratite monophyly with strong support, although these taxa generally group together" (Cracraft et al. 2004:474).

    Hyobranchiální aparát (jazylka) u moa jižního (nahoře) a kiviho (dole). Význam zkratek: (B) basihyale, (Cb) ceratobranchiale, (Eb) epibranchiale, (P) paraglossale, (U) urohyale. Bock & Bühler (1990) zaznamenali v rámci paleognátího jazylkového aparátu značnou variaci. U tinam a nanduů jsou deskovitá paraglossalia navzájem srostlá, zatímco tenké, tyčinkovité basihyale se k nim připojuje skrze masivní šikmý jazylkojazykový sval (musculus hyoglossus obliquus); zatímco pštrosi mají paraglossalia dlouhá, tenká, nesrostlá a široké basihyale se s nimi kloubí přímo svým anterolaterálním povrchem. Šikmý jazylkojazykový sval pštrosům zcela chybí (Bock 2003). Z těchto dat se toho o fylogenezi mnoho nedozvíme bez předpokladů o směru, v němž změny probíhaly; další data však ukázala, že Bock a Bühler se ohledně bazální pozice pštrosů nemýlili. Johnston (2011) např. ukázal, že všechny paleognáty mimo pštrosů a madagaskarských sloních ptáků můžeme sjednotit odvozeným zkrácením epibranchialií. (Modifikováno z Johnston 2011: Figure 2).

        V roce 2006 došlo ke dvěma významným událostem. Grellet-Tinner (2006) našel další ještě neodzkoušený zdroj dat, totiž vejce a vaječnou skořápku. Do své analýzy zahrnul i fosilní taxony a opět mu vyšlo, že "běžci" nejsou monofyletičtí, jelikož jsou mezi ně vnořeny tinamy. Topologie ovšem neměla u báze paleognátího stromu pštrosa a obecně vůbec nepřipomínala nic, co bylo dosud navrženo (viz níže). Podstatnější ale bylo, že se skupina molekulárních fylogenetiků rozhodla, že už by bylo dobré s podobnými problémy a ptačí fylogenezí obecně tak nějak pohnout, a že by bylo zajímavé podívat se, co s ní udělají čtyři miliony nukleotidů (Harshman et al. 2006). Tak se zrodil projekt Early Bird. Své první ovoce přinesl v roce 2008 – přesnější by ale asi bylo napsat, že v roce 2008 do ornitologické systematiky prudce vtrhl a postavil ji na hlavu. Chojnowski et al. (2008) nejprve fylogenetickou analýzou těžkých řetězců klatrinu ukázali, že uvnitř ptáků nemáme žádnou "tvrdou polytomii", kterou by nešlo rozřešit ani se sebevětším množstvím dat, ale že k dosažení správného stromu bude třeba nejméně 32 kilobází převážně intronových, rychle se vyvíjejících sekvencí. O pět měsíců později Hackett et al. (2008) publikovali novou obří ptačí fylogenezi, založenou (jaká to náhoda!) na 32 kilobázích převážně intronových sekvencí. Stejně jako u Chojnowskiho i spol., i zde byli přítomní monofyletičtí paleognáti, ale ne monofyletičtí "běžci" – a i zde se opět jako první od ostatních paleognátů odštěpoval pštros. Hackett et al. (2008) naneštěstí publikovali v Science, a tak byli rádi, že se jim do vyhrazeného 5-stránkového prostoru vůbec vešly všechny grafy a stromky; na nějaké důkladnější prozkoumávání evolučních implikací překvapivého zjištění jaksi nebylo místo.
        To napravili Harshman et al. (2008), kteří si všemožně pohráli s volbou outgroup, fylogenetickými metodami (parsimonie, věrohodnost, Bayes), dělením sekvenčních dat na oddíly podléhající různým substitučním modelům a RY-kódováním (puriny/pyrimidiny místo A/T/C/G). Ze všech analýz jim vylezl silně podpořený klad nepštrosích paleognátů (bootstrap 90–100%, 17 z 20 lokusů existenci kladu podporují pod věrohodností, 15 z 20 pod parsimonií). A nejen to. Ukázali, že tyto výsledky nelze vysvětlit žádným ze známých jevů molekulární evoluce, které zkreslují fylogenetický signál, ale že pouhým artefaktem klidně mohla být podpora pro "běžčí" monofylii v předchozích analýzách. Tinamy totiž po celém svém genomu vykazují výrazně vyšší rychlost molekulární evoluce než všichni ostatní paleognáti. Díky tomu jsou na fylogenetickém stromě reprezentovány dlouhou větví (délka větve udává množství změny na této větvi), a ta má tendenci přitahovat se k dalším dlouhým větvím: každou nukleotidovou pozici mohou obsadit jen 4 báze, a rychle se vyvíjející taxony často náhodně vyvinou stejnou bázi na větším počtu pozic, než v kolika se shodují se svými skutečnými příbuznými. A protože nejdelší větve zpravidla vedou k outgroup, tinamy zákonitě skončily u báze paleognátů, tj. tam, kam je kladla i většina morfologických dat. Jak navíc zdůraznili Phillips et al. (2010), některé analýzy mtDNA se vůbec nenamáhaly "běžčí" monofylii testovat a předem si ji vynutily buď použitím tinam coby outgroup (Cooper et al. 2001), nebo omezením prostoru možných stromů (Paton et al. 2002).
        Harshman et al. (2008) také okamžitě poukázali na to, že pokud je jejich fylogeneze správná, odpadá nutnost slaďovat ji s rozpadem Gondwany. Jsou-li tinamy usazeny uvnitř "běžců", je rozumnější předpokládat, že různí "běžci" schopnost letu nezávisle na sobě ztratili, než to, že ji tinamy vyvinuly nezávisle na všech ostatních ptácích. Tuto druhou hypotézu zastával Oliver (1945), podle nějž jsou tinamy "běžci", kteří se naučili létat ("Tinamous might otherwise be looked upon as Ratite birds which have attained to flight" – Oliver 1945:75), jinak se ale zdá být extrémně nepravděpodobná: zatímco v rámci obratlovců víme o desítkách a (v případě pacifických chřástalů) stovkách nezávislých ztrát aktivního letu, s jistotou známe jen tři jeho zisky (pterosauři, ptáci, letouni). A pokud dokázali bazální zástupci všech velkých skupin paleognátů létat, pak nebyli odkázáni na to, kam je kontinentální drift zanese, ale mohli oceány překonat vlastními silami. Biogeografii ovšem komplikoval i fakt, že Harshman et al. (2008) nedokázali rozhodnout, jak přesně příbuzenské vztahy nepštrosích paleognátů vypadají. Předchozí analýzy (Chojnowski et al. 2008; Hackett et al. 2008) tinamy shodně odkryly coby sesterskou skupinu australasijských běžců (kiviové + kasuárovití), a zatímco Harshmanovi a spol. některé z dílčích analýz vyhazovaly stejný vztah, jiné podporovaly spíše sesterský vztah tinam a nanduů (viz níže).
        Phillips et al. (2010) obdivuhodně důkladně přezkoumali fylogenetický potenciál mitochondriálních dat. Nejprve zohlednili rozdíly mezi sekvencemi kódujícími RNA a mezi sekvencemi kódujícími proteiny, pak rozdělili ty první do oddílů odpovídajících stonkům (stems) a smyčkám (loops) a ty druhé podle kodonových pozic, přičemž pro třetí pozici, v níž je rychlost substituce (a tedy i eroze fylogenetického signálu) největší, využili RY-kódování, díky němuž se pro analýzu stanou viditelné pouze vzácnější transverze (přechody z purinu na pyrimidin a naopak). Každý oddíl dostal samostatný substituční model vybraný Akaikeho informačním kritériem (AIC) a s ním i samostatnou sadu délek větví. Autoři nezapomněli ani otestovat, jak dobře si toto dělení dat vede oproti rozdělením alternativním (třeba jeden model pro každý gen), a zjistili, že jej favorizuje AIC i Bayesův faktor*. Všechna tato fylogenetická magie nakonec opět ukázala pštrosy jako sesterskou skupinu všech ostatních paleognátů, ačkoli ne se zvlášť silnou podporou. Druzí nejbazálnější byli nanduové, zatímco tinamy tvořily mimořádně silně podložený klad s ptáky moa (bootstrap 99%), od nichž už také známe kompletní mtDNA. Klad složený z moa a tinam byl pak sesterským taxonem australasijských běžců tak jako v Hackett et al. (2008); tento výsledek ale opět nebyl příliš robustní vůči bootstrapu. Po odstranění tinam z analýzy však žádný z těchto uzlů nezmizel a podpora jim naopak povyrostla – což ukazuje, že dlouhá větev tinam měla na analýzu rušivý vliv, ale ne dost rušivý na to, aby zkreslila výsledky.

    *Bayesův faktor je dalším nástrojem pro volbu modelů a představuje alternativu k tradičním informačním kritériím typu AIC. Ta jsou založena na vzorečku, který porovnává pravděpodobnost dat vzhledem k testovanému modelu s počtem parametrů tohoto modelu. Bayesův faktor je prostý poměr marginálních věrohodností (marginal likelihoods) dvou modelů – parametry modelu "vyintegruje" (marginalizuje). Výsledné číslo není nejvyšší věrohodnost, jaké se dá s modelem dosáhnout, ale průměr přes různé hodnoty jeho parametrů, vážený podle priorního rozdělení těchto parametrů. Lze ukázat, že takový přístup přebytečné parametry penalizuje automaticky. Bayesovský fylogenetik Paul O. Lewis to nádherně předvádí na obrazcích a krychličkách.

        Phillips et al. (2010) nemohli – jak zdůrazňuje nedávná revize ptáků moa (Worthy & Scofield 2012), která se pokoušela jejich hypotézu o sesterském vztahu moa a tinam otestovat morfologickými daty* – zavrhnout ani několik alternativních topologií, v nichž na bázi paleognátů stáli buďto nanduové, klad (nanduové + pštrosi) nebo klad (moa + tinamy). Pštrosa jako nejbazálnějšího paleognáta ale podporují i jaderná data, takže důvěra v tento výsledek je tedy celkem na místě, a autoři se rozhodli prozkoumat i jeho biogeografické důsledky. Tam, kde Harshman a spol. navrhli pouze odpočinout si od spekulací o rozpadu Gondwany, použili Phillips et al. (2010) molekulární hodiny k dataci jednotlivých divergencí. Jejich kalibrační body byly (tak jako celá studie) mimořádně důkladně promyšleny: základem bylo 5 konzervativních externích kalibrací. Interní kalibrace (používající taxon Emuarius pro divergenci emu/kasuár a Diogenornis pro divergenci nanduů od zbytku paleognátů) byly vyzkoušeny, ale analýza se na ně nespoléhala, protože řazení emuára (trochu o něm zde) se zakládá na spekulacích o tom, v čem jsou kasuár a emu pleziomorfičtí, zatímco postavení diogenornise v rámci nanduovitých autoři označili za nejisté – a dobře dělali; nedlouho po publikaci jejich práce ho Alvarenga (2010) na ornitologickém kongresu navrhl přeřadit do kmenové linie kasuárovitých. Ukázalo se, že divergence mezi paleognáty jsou příliš mladé, než aby mohly být vysvětleny rozpadem Gondwany. Pštrosi se např. měli od zbytku paleognátů oddělit před 83 (externí kalibrace) nebo 78 (externí i interní kalibrace) miliony let a podle nejvyššího přijatelného odhadu pak před 103 miliony let, zatímco Afrika se od zbytku Gondwany odtrhla už asi před 110 miliony let. Divergence pštrosů je vlastně jediná, která proběhla ještě před rozpadem jižní Gondwany (tj. Nový Zéland, Antarktida, Austrálie), jímž se obvykle složitě vysvětlují propletené biogeografické historie kiviů, kasuárovitých a ptáků moa – podle Phillipse a spol. však v této době ještě žádný z těchto taxonů neexistoval.

    *Skutečně jen "pokoušela". Autoři si po úspornostní analýze pomocí tzv. "backbone constraint" vynutili klad zahrnující moa a tinamy, který nesměl zahrnovat kivie, kasuára, sloní ptáky ani jeden taxon nandua. Poněkud překvapivé potom je, že analýza s předem omezenou topologií "failed to unite tinamous and moa as a clade" (Worthy & Scofield 2012:107). I na stromu vzešlém z omezené analýzy byli "běžci" nadále monofyletičtí a moa měli ke sloním ptákům, kiviům i nanduům blíž než k tinamám.

        Pštrosi tak zřejmě nejsou v Africe původní: dost možná přešli z původní domoviny paleognátů kdesi v Jižní Americe přes pevninský most v oblasti dnešních Antil do Laurasie, odkud do Afriky pronikli až při eurasijsko-africké faunální výměně na přelomu oligocénu a miocénu. Dávalo by to smysl, neboť až do miocénu není v Africe po pštrosech (ani žádných jiných "běžcích") ani stopy. Phillips et al. (2010) si navíc neodpustili ještě jednu analýzu, a to rozbor ancestrálních oblastí výskytu pro jednotlivé uzly paleognátního stromu. V ní byly spočteny pravděpodobnosti s jakou ten který klad vznikl 1) v Africe, jižní Gondwaně, nebo na severní polokouli (pro paleognáty a klad nepštrosích paleognátů), 2) v Jižní Americe, Austrálii, nebo na Novém Zélandu (pro všechny další podskupiny). Autoři vzali v úvahu nejen diogenornisy, ale i "evropského pštrosa" paleotida (Houde & Haubold 1987) a směsku létavých paleognátů litornitidů. Výsledky byly tristní. Klad nepštrosích paleognátů sice vznikl v jižní Gondwaně (a nejspíše na území Jižní Ameriky), ale u paleognátů jako celku už situace tak jistá není a nelze vyloučit, že ikonická "gondwanská" skupina vznikla na severní polokouli, tj. zcela mimo Gondwanu. Maximální věrohodnost tomuto scénaři přiřazuje pravděpodobnost 0,18 a parsimonie jej dokonce preferuje.

    Hypotézy o non-monofylií "běžců". (A) Cracraft et al. 2004 – tinamy ponořeny neobvykle hluboko mezi "běžce". (B) Projekt Early Bird. Strom vlevo podpořili Harshman et al. 2008 (20 lokusů, 24 kilobází) s parsimonií a věrohodností s RY-kódováním, strom vpravo pak vyšel Harshmanovi et al. (2008) v bayesovské a normálně kódované věrohodnostní analýze, Hackett et al. 2008 (19 lokusů, 18 totožných, 32 kilobází) a Chojnowski et al. 2008 (2 lokusy, oba shodné s Harshmanem a spol., 3,5 kilobází). (C) Grellet-Tinner 2006 – vejce a vaječná skořápka. Vlevo původní strom, který sice vykazuje non-monofylii "běžců", ale kořen má v neobvyklém místě. Uprostřed tentýž strom "odkořeněný" a s dvěma možnými pozicemi kořene – jednak tou původní, jednak tou mezi pštrosy a zbytkem paleognátů. Vpravo tentýž strom zakořeněný podle druhé varianty. (D) Phillips et a. 2010 (kompletní mtDNA, 14 kilobází). Dataset zahrnoval i ptáky moa a dokonce i krátký úsek (880 bází) od sloních ptáků. Moa se jednoznačně připojili k tinamám a pozice obou skupin dohromady se shodovala s výsledky Hackett et al. (2008), sloní ptáci se zdáli být nejblíže příbuzní kiviům*, avšak nešlo zamítnout ani 4 pozice alternativní (viz stromek). (E) Morfologie: Johnston 2011. Vlevo konsenzus nejúspornějších stromů založených na 47 primárních znacích. Přidání 38 dalších znaků (viz níže) mnoho nezměnilo, pouze seskupilo dohromady moa a kivie. Vpravo většinový konsenzus z 1000 bootstrapových pseudoreplikátů. Větší kompatibilita s výsledky molekulárních studií je vykoupena ztrátou rozlišení. Vytvořeno s nástrojem PhyloPainter (© 2010 Mike Keesey | namesonnodes.org/phylopainter) a s MS Paint, za což se co nejpokorněji omlouvám.

    *Příjemně mě překvapilo, když jsem se z vynikajícího článku Mateje Dolinaye dozvěděl, že těchto pár stovek bází není jediným důkazem, který pro případnou bizarní skupinu složenou z miniaturních kiviů a půltunových epyornitidních obrů máme – oba taxony sdílejí podobné proporce kosti kyčelní. Matejův článek ale současně uvádí i podobnosti sloních ptáků a kasuárovitých, což je další vztah, který na základě mtDNA nelze zamítnout.

        Zachránit lákavý scénář paleognátů opouštějící své bratrance na vorech v podobě postupně se odlamujících kontinentů zkusili po Phillipsovi a spol. Johnston (2011) a Allentoft & Rawlence (2011). Johnston vzal data shromážděná Bockem, Bühlerem, Elżanowskim a Grellet-Tinnerem a (na rozdíl od prvních tří) je zahrnul do numerické fylogenetické analýzy. Navíc popsal jazylkový aparát i od těch paleognátů, u nichž příslušná data dosud chyběla, a přidal znaky z prstů na křídlech. Pravda, to vše stále dalo dohromady jen směšných 47 znaků, takže Johnston tento "core dataset" zkusil doplnit osteologickými a myologickými znaky převzatými z několika předchozích studií (čímž se počet znaků vyšplhal na závratných 85). Malý dataset by ještě nebyl žádnou katastrofou – existují i studie, které je v případě morfologických znaků přímo doporučují (Scotland et al. 2003). Horší je Johnstonova metodologie, jíž jsem na blogu pomlouval opakovaně. Autor apriorně rozhodoval, který znakový stav je primitivní a který odvozený, přičemž sám uznal, že takový postup je v dnešní době neobvyklý. Poskytl sice aspoň explicitní a ozdrojovaný seznam předpokladů, které při výběru primitivních stavů použil, ale zde je problematická spíš celá filozofie takového postupu. Proč strom prostě nezakořenit nějakým neognátem? Ten by měl k paleognátům blíž než všechny komponenty Johnstonovy "teoretické outgroup" (Archaeopteryx, bazální maniraptoři, hatérie) a kódovat by jej šlo na všechny znaky současně. No, protože neognáti vykazují skoro v každém znaku stejný stav jako tinamy, a tak "cannot be assumed to place the root in a correct ancestral position" (Johnston 2011:962). Když ale předem víme, jaká pozice kořene je "correct", proč vůbec něco analyzovat?
        Johnstonovi nakonec skutečně vyšlo cosi dost podobného molekulárním fylogenezím, několik rozdílů zde ale bylo. Vztah mezi nanduy (N), tinamami (T) a australasijskými běžci (A) byl odkryt jako (T, (N, A)), což neodpovídá ani jedné z alternativ předložených Harshmanem a spol., tedy buď (N, (T, A)) nebo ((N, T), A). Ptáci moa byli odkryti buď jako sesterská skupina kiviů (85 znaků), nebo v polytomii s kivii a kasuárovitými (47 znaků), což v obou případech odporuje jednomu z nejpevnějších výsledků Phillipse a spol. Sloní ptáci se neukázali vedle kiviů, ale v polytomii s pštrosy a všemi ostatními paleognáty, což Johnstonovi umožnilo vysvětlovat biogeografii paleognátů striktní vikariancí: pokud se madagaskarští sloní ptáci oddělili od zbytku paleognátů jako první (čemuž výše zmíněná polytomie neodporuje), pěkně to sedí s faktem, že z Gondwany se ze všeho nejdřív odštěpil Indo-Madagaskar. Na rozdíl od Phillipse a spol. také u Johnstona novozélandští paleognáti (moa a kiviové) tvoří výlučný klad. To vše ale vyžaduje, aby se společný předek paleognátů v Gondwaně vyskytoval už před 110 miliony let: tehdy nejpozději došlo k separaci Indo-Madagaskaru. To je extrémně spekulativní ze dvou důvodů. Zaprvé, nejstarší fosilní paleognáti jsou známí ze souvrství Hornerstown (Phillips et al. 2010), spadajícího buď do nejpozdnější křídy, nebo nejranějšího paleocénu, tj. do doby asi před 66 miliony let. Johnstonova datace tak vyžaduje 44 milionů let evoluce, která je ve fosilním záznamu naprosto neviditelná – a to jen proto, aby bylo učiněno za dost předpokladu vikariance. Podle Johnstona se navíc paleognáti začali diverzifikovat dříve, než podle dnešního konsenzu vůbec vznikli moderní ptáci jako celek (Brown & van Tuinen 2011; Lindow 2011).
        Podstatně skromnější návrh přednesli Allentoft & Rawlence (2011). Podle nich je možné, že vikariance stála za novozélandským výskytem kiviů a ptáků moa: předci obou skupin sem nemuseli doletět z Antarktidy a Jižní Ameriky, což je jediná možnost, kterou spatřovali Phillips et al. (2010). Své tvrzení zakládají na nedávných počítačových modelech geologických dat, podle nějž sice odtrhávání Nového Zélandu skutečně začlo už před nějakými 85 miliony let, ale na severu nebylo plně hotovo až do doby před 60 nebo 55 miliony let. Protože moa od tinam i kiviové od kasuárovitých se podle Phillipse a spol. oddělili právě před 60 miliony let, není vyloučeno, že předci moa a kiviů ztratili let velice brzy po separaci od svých sesterských taxonů a stihli přejít suchou nohou na Nový Zéland, než jej od Austrálie definitivně odtrhlo Tasmanovo moře. Alespoň pro kivie je taková hypotéza pravděpodobná: parsimonie velí předpokládat, že poslední společný předek kiviů a kasuárovitých už létat neuměl.

    3. Acknowledgments

        Děkuji Nicolási Diezovi a Janu Zrzavému za to, že mi umožnili přístup k fulltextu některých zde shrnutých studií – a Nicolási Diezovi dále za to, že jsem se o některých z nich v první řadě vůbec dozvěděl.

    Zdroje: